為您帶來(lái)ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)優(yōu)化做到這五點(diǎn),下個(gè)大神就是您!
一、封閉液、洗滌液及保護(hù)液的優(yōu)化
1.封閉液的優(yōu)化：采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行封閉。其封閉液的組成為：10mM磷酸鹽緩沖液含1%的牛血清白蛋白(BSA)。
2.洗滌液的配制：采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法配制洗滌液。
3.酶標(biāo)板保護(hù)液的優(yōu)化：酶標(biāo)板經(jīng)過(guò)封閉后在低溫下僅能存放2周左右，為了延長(zhǎng)固相酶標(biāo)板上抗原的穩(wěn)定性，我們?cè)黾恿艘徊奖Ｗo(hù)酶標(biāo)板的程序。在10mM的磷酸鹽中加入適量的糖、無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)、慶大霉素以及二價(jià)金屬離子，作為酶標(biāo)板保護(hù)劑，在封閉完后加入保護(hù)液于4℃冰箱中孵育放置一個(gè)晚上，同時(shí)與未做保護(hù)的酶標(biāo)板進(jìn)行對(duì)照，然后將保護(hù)的及未保護(hù)的酶標(biāo)板置于37烘箱中放置15天，考察保護(hù)液對(duì)酶標(biāo)板的穩(wěn)定性的影響。
二、酶標(biāo)抗體稀釋度的優(yōu)化
抗原包被濃度為4ug/ml,將酶標(biāo)抗體做系列稀釋?zhuān)?:100，1:200；1:300；1:400；1:500；1:600；1:1000；經(jīng)孵育、洗滌后、顯色終止后，用自動(dòng)酶標(biāo)儀分析，選擇A值為1.5左右的酶標(biāo)抗體稀釋度為zui適工作濃度。
三、底物液的優(yōu)化
常用的作為酶聯(lián)免疫吸附試劑有OPD和TMB系統(tǒng)，由于OPD有致癌的危險(xiǎn)性以及用前需要溶解等諸多缺點(diǎn)，因此我們選用TMB作為底物系統(tǒng)，采用文獻(xiàn)報(bào)道的方法：取適量的TMB溶解在DMSO中，然后加入適量的超純水，配制作為底物B液；溶解適量的過(guò)氧hua氫尿素于100mM磷酸-檸檬酸緩沖液中，配制作為底物A液，用前將底物A液及底物B液等體積混合。在文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，上海樊克適當(dāng)調(diào)整了TMB的用量以及過(guò)氧hua氫尿素的用量，并加入了酶促進(jìn)劑，與文獻(xiàn)報(bào)道的底物進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)方案為：將活化的辣根過(guò)氧hua物酶分別作1:1000；1:10000；1:100000；1:200000；1:400000；1:800000等系列稀釋?zhuān)容^兩種不同配方的底物的靈敏度。
四、抗原抗體反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化：
抗原抗體反應(yīng)會(huì)隨著時(shí)間的增加，反應(yīng)量也增加，但達(dá)到一定的時(shí)間后，反應(yīng)即達(dá)到平衡，我們?nèi)》磻?yīng)10min，20min，30min，40min，50min，60min，70min,90min等8個(gè)點(diǎn)進(jìn)行比較，以確定zuijia抗原抗體反應(yīng)時(shí)間。
五、底物作用時(shí)間的優(yōu)化
在其它條件相同的情況下，我們?nèi)?min,10min,15min,20min,25min,30min,35min,40min,50min,60min,80min等11個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較，確定zuijia的底物作用時(shí)間。
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